2017年6月28日，國際學術權威刊物自然出版集團旗下子刊《Nature Chemical Biology》雜志在線發表了清華大學醫學院李海濤研究組、美國得克薩斯大學MD安德森癌癥中心Mark Bedford教授研究組與意大利薩萊諾大學Gianluca Sbardella教授研究組合作的題為《應用蛋白陣列技術研發Spindlin1小分子抑制劑》(Developing spindlin1 small-molecule inhibitors by using protein microarrays)的合作研究論文，通過構建組蛋白閱讀器結構域蛋白芯片，并結合基于結構的構效關系演化，開發出專門針對Spindlin1的活性小分子抑制劑，為今后模式結構域(modular domain)靶向的藥物篩選與開發提供了一種新技術模式。博士后蘇曉楠為論文并列第一作者，李海濤教授與Mark Bedford教授和Gianluca Sbardella教授為共同作者。

組蛋白修飾是表觀遺傳調控基本機制之一，被認為構成一類“組蛋白密碼”，調控著遺傳信息在染色質層面的組織與解讀。組蛋白修飾的一種作用模式是招募一類被稱作“閱讀器”(reader)的效應因子，通過調節染色質開關狀態而調控基因活度和染色質結構，進而影響細胞分裂、增殖、分化和凋亡等眾多細胞進程。值得注意的是，在癌癥等眾多疾病中存在組蛋白修飾及其“閱讀器”識別紊亂調控的現象。近年來，組蛋白“閱讀器”逐漸成為藥物研發中的一類重要靶點，一個著名的例子是BRD4的Bromo結構域。能夠識別組蛋白修飾的“閱讀器”結構域種類繁多，如PHD鋅指、Tudor、Chromo、PWWP、MBT、BAH、Bromo、YEATS等，他們能夠以修飾位點和類型特異的方式來識別并破譯“組蛋白密碼”。因此，尋找針對組蛋白閱讀器的特異抑制劑，是當前表觀遺傳領域藥物研究的一個熱點。

組蛋白甲基化是一類重要的組蛋白修飾，主要發生在賴氨酸和精氨酸等殘基上，通?？梢员弧伴喿x器”中的芳香籠口袋(aromatic cage)識別并解讀。鑒于芳香籠口袋的結構相似性，開發特異靶向不同甲基化“閱讀器”的小分子抑制劑成為一個領域挑戰。本研究首先通過構建組蛋白賴氨酸甲基化“閱讀器”結構域蛋白陣列芯片，其中涉及隸屬Tudor、Chromo、PHD、BAH、MBT、PWWP、ANK、AGENET、HEAT等類型的蛋白結構域共98個;隨后，采用一種基于熒光的檢測手段對生物素標記的小分子抑制劑進行針對該98個潛在“閱讀器”靶點的“lab-on-chip”高通量評估和篩選。利用該項技術研究組成功篩選出EML405小分子的潛在靶點Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、53BP1等，并在體外結合實驗中得到驗證。

李海濤研究組曾于2014年在《基因與發育》發文報導Spindlin1是一類新型組蛋白“閱讀器”，其含有三個串聯重復類Tudor結構域，通過前兩個類Tudor結構域特異性識別組蛋白“賴氨酸-精氨酸”甲基化組合，H3“K4me3-R8me2a”，進而激活Wnt靶基因的轉錄，是結腸癌等諸多癌癥發生中的促癌因子。以Spindlin1為突破點，李海濤研究組通過X射線晶體衍射技術揭示了EML405小分子結合Spindlin1的結構基礎。研究發現EML405小分子的兩臂恰巧結合在Spindlin1的前兩個功能性芳香族口袋中，阻斷其對組蛋白H3“K4me3-R8me2a”的識別。在Spindlin1-EML405的復合物結構基礎上，研究人員進一步優化出EML405小分子的衍生體EML631、EML632、EML633，并系統的開展了EML631-633與Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1靶點的定性、定量結合分析。結果發現EML衍生小分子能夠大大提高Spindlin1靶點的識別特異性，其中EML631以4微摩爾親和力結合Spindlin1，而對PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1靶點的結合能力降到亞毫摩爾級別。Spindlin1-EML631的晶體結構解析進一步揭示了EML631對Spindlin1高度選擇性的分子機制。同時，RNA-seq和ChIP-qPCR結果顯示，EML631能夠有效抑制Spindlin1激活基因轉錄的活性。因此，本工作以組蛋白“閱讀器”蛋白芯片為切入點，開發出針對Spindlin1靶點的特異性小分子抑制劑，這為今后以模式結構域為靶點的特異小分子篩選開發建立了一個新型研發模式。

圖 利用蛋白陣列篩選小分子抑制劑

原文鏈接：

Developing Spindlin1 small-molecule inhibitors by using protein microarrays

原文摘要：

The discovery of inhibitors of methyl- and acetyl-binding domains has provided evidence for the 'druggability' of epigenetic effector molecules. The small-molecule probe UNC1215 prevents methyl-dependent protein-protein interactions by engaging the aromatic cage of MBT domains and, with lower affinity, Tudor domains. Using a library of tagged UNC1215 analogs, we screened a protein-domain microarray of human methyllysine effector molecules to rapidly detect compounds with new binding profiles with either increased or decreased specificity. Using this approach, we identified a compound (EML405) that acquired a novel interaction with the Tudor-domain-containing protein Spindlin1 (SPIN1). Structural studies facilitated the rational synthesis of SPIN1 inhibitors with increased selectivity (EML631–633), which engage SPIN1 in cells, block its ability to 'read' H3K4me3 marks and inhibit its transcriptional-coactivator activity. Protein microarrays can thus be used as a platform to 'target-hop' and identify small molecules that bind and compete with domain-motif interactions.